N6-methyladenosine（m6A）是真核生物mRNA上含量最丰富的化学修饰之一，由甲基转移酶复合物（Writer）所添加，主要被含有YTH结构域的Reader识别，并且可以被FTO和ALKBH5等Eraser去除。m6A甲基转移酶复合物由进化中保守的7个成员构成，包括催化组分Mettl3，以及Mettl14, WTAP (Fl(2)d), VIRMA (Vir), RBM15 (Nito), ZC3H13 (Xio or Flacc)和Hakai，其中Hakai作为一个潜在的RING finger E3泛素连接酶是研究最少的。

严冬课题组前期筛选和鉴定了m6A甲基转移酶复合物和果蝇性别决定通路两个新的组分Nito（PNAS, 2015）和Xio（也称为Flacc）（PNAS, 2018），并参与了果蝇m6A修饰通路的整体解析。2021年4月12日，在Nature Communications杂志上发表题为“Role of Hakai in m6A modification pathway in Drosophila”的文章。本文是作者m6A甲基转移酶复合物研究三部曲之一，证明了Hakai是m6A 修饰通路核心成员之一，解析了它及其它成员的作用机制，并发现了性别特异性的m6A修饰方式。

首先，作者验证了Hakai与其他m6A writer组分存在相互作用，并且Hakai突变体果蝇表现出特征性的m6A通路表型，例如mRNA中的m6A修饰水平降低，Sxl（Sex lethal）及其它基因的可变剪接出现异常，成虫翅膀姿势异常和不能飞行，以及在MeRIP-seq实验中减少的m6A峰与Mettl3和Mettl14突变体相一致。这些数据清楚表明Hakai是保守的m6A甲基转移酶复合物的核心组分之一。

随后，作者对m6A writer多个组分的作用机理进行了较为系统的研究，发现Fl(2)d, Vir, Hakai和Flacc形成稳定的复合物，敲除Fl(2)d, Vir或Hakai导致其它三个组分的降解，但是Mettl3, Mettl14和Nito不受其影响。敲除Flacc导致Fl(2)d的细胞核染色减少，与之前细胞系中报导的结果相一致。基于这些结果，作者提出了m6A甲基转移酶复合物的工作模型（图1）。

图1. m6A甲基转移酶复合物

Hakai最初在人类细胞中被鉴定出来，它与钙粘蛋白(E-cadherin)相互结合并导致其泛素化，从而促进E-cadherin的内吞和降解。但是，作者使用多种遗传工具进行的体内分析未发现Hakai在E-cadherin调节中的作用。并且Hakai是一种普遍存在的核蛋白，几乎与膜上的E-cadherin没有共定位。因此，这一模型需要使用基因敲除小鼠进行进一步解析，此外还需要寻找Hakai作为潜在E3连接酶的底物。

通过在野生型成虫以及Mettl3，Mettl14和Hakai突变体中进行MeRIP-seq，发现尽管大多数m6A修饰峰分布在3'UTR中，但在m6A writer突变体中下降的峰则主要是位于5'UTR中。而在哺乳动物中，m6A峰则主要富集在3'UTR和终止密码子附近。3'UTR中的m6A修饰通常会导致mRNA的不稳定，而5'UTR中的m6A与翻译增强有关。作者没有观察到与野生型相比，Mettl3突变体中m6A靶标的mRNA半衰期增加，暗示m6A修饰在果蝇中的主要作用不是在mRNA降解上。

该文中最有趣的发现可能是展示了围绕Sxl关键外显子的雌性特异性m6A修饰。Sxl是教科书上关于可变剪接的经典范例：雄性剪接形式包含外显子3，该外显子含有终止密码子并导致Sxl蛋白翻译的早期终止；而雌性剪接形式则跳过外显子3并因此产生功能性的Sxl蛋白。最近，m6A修饰途径被证明调控Sxl的可变剪接，但是m6A修饰与Sxl蛋白协同调节其自身剪接的详细机制仍不清楚。作者MeRIP-seq数据显示，只有在雌性中，Sxl外显子3及其周围存在m6A修饰，并且位于Sxl结合位点附近（图2）。m6A-IP-qPCR进一步验证了这一发现，并表明这些修饰在Mettl3突变体雌性果蝇中下降。这一出乎意料的发现提示了一种模型，即Sxl的一个主要功能可能是招募m6A writer复合体从而甲基化附近的m6A位点。m6A reader Ythdc1然后结合到这些位点，并可能与剪接机器相互作用以抑制剪接。

图2. Sxl与m6A修饰共同调控其可变剪接的模型